Isolasi DNA pada Tanaman

 

PENDAHULUAN

Kromosom adalah stuktur kompak yang terdapat di dalam inti sel dan terdiri dari benang DNA dan sejumlah protein. Struktur kromosom merupakan struktur DNA yang paling mudah dilihat pada fase – fase tertentu pembelahan nukleus ketika kromosom berada dalam keadaan terkumpar. Kromosom yang mengandung DNA, berfungsi dalam pewarisan sifat dan regulasi selular terutama sintesa protein. Masing – masing kromosom dapat dibedakan berdasarkan panjang relatif, letak sentromer, keberadaan kromomer, dan keberadaan struktur satelite. Berdasarkan letak sentromernya, kromosom dapat dibagi menjadi beberapa jenis, yaitu metasentrik, submetasentrik, dan telosentrik. Berdasarkan fungsinya kromosom dapat dibagi menjadi dua, yaitu autosom, dan gonosom. Autosom adalah kromosom yang mengandung gen – gen terkait regulasi metabolisme di seluruh tubuh makhluk hidup, sementara gonosom adalah kromosom yang mengandung gen – gen terkait regulasi metabolisme perkembangan seks ( Elrod dan Stansfield 2002). Gen – gen pada kromosom dapat dimodifikasi dengan teknologi rekayasa genetika, dengan bantuan plasmid. 

Gambar. Kromosom dalam sel (sumber: sumberpendidikan.com)

Manfaat isolasi DNA adalah memudahkan dalam analisis genetik, analisis di bidang ilmu forensik dan medis, pementaan genom dan analisis kesamaan genetik. Keberhasilan proses isolasi DNA seringkali sangat menentukan hasil pekerjaan selanjutnya. Sementara itu, isolasi DNA plasmid bermanfaat untuk karakterisasi suatu plasmid yang ada di dalam suatu bakteri dan berguna untuk pengembangan teknologi rekombinan. Teknologi pemotongan DNA kromosom maupun DNA plasmid berguna dalam sekuensing DNA dan menentukan urutan basa DNA dalam proyek genom (Maftuchah et al. 2012).  Tujuan dari praktikum ini adalah menganalisis isolasi kromosom kunyi dan jahe.

METODE

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan yaitu mortar, perangkat elektroforesis, sentrifus, tabung sentrifus, neraca,pipet mikro, tip, tabung effendorf, gelas piala, labu takar, pH meter, tabung Erlenmeyer, gelas piala, Uv transiluminator, incubator dan vortex.

Bahan-bahan yang digunakan adalah daun jahe merah, daun kunyit, Tris Hcl 25 mM, EDTA 10 mM, sukrosa 15 %, NaOH 0.2 M, SDS 1 %, larutan Na asetat 3 M pH 4.6, larutan fenol:kloroform, etanol absolut, etanol 70 %, dH₂O steril, akuades, media NB, 0.5 g ekstral khamir, 1 g tripton, 0.5 g NaCl, 50 ppm ampicillin, DNA plasmid, Buffer restriksi, enzim retriksi, pewarna Etbr, buffer ekstraksi, buffer lisis 1 (SDS 20 %), buffer lisis 2 (potassium asetat 5 M), larutan kloroform;isoamilalkohol (24:1), alcohol dingin 100%, buffer TE, agarosa, asam borat, loading dye, es batu dan DNA marker 1 kb.

Prosedur

Isolasi Kromosom Daun Jahe Merah dan Kunyit

Daun Jahe merah dan kunyit dipotong-potong dan digerus sampai halus dalam mortar yang disimpan dalam baskom yang diisi es. Hasil gerusan dimasukan ke tabung effendorf. Kemudian ditambahkan buffer ektraksi dengan volume 4 kali volume awal sampel dan 50 µL larutan buffer 1. Selanjutnya panaskan pada suhu 65 ^oC selama 15 menit. Kemudian ditambahkan 100 µL larutan buffer 2 dan kocok selama 10 menit dan sentrifus pada kecepatan 14000 rpm selama 5 menit. Supernatan hasil sentrifus dipindahkan pada tabung effendorf baru dan pellet dibuang. Selanjutnya supernatant ditambahkan larutan kloroform sebanyak setengah dari volume awal sampel. Tabung dibulak balik sampai homogen dan disentrifus kembali dengan kecepatan 14000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan pada tabung effendorf baru dan ditambahkan larutan isopropanol dingin sebanyak 2 kali volume awal sampel. Selanjutnya tabung didiamkan dalam wadah berisi es selama 30 menit dan selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm dalam waktu 5 menit. Supernatant dibuang, kemudian pellet ditambahkan dengan 1 mL etanol dan dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung. Selanjtnya dilakukan sentrifugasi kembali dengan kecepatan 14000 rpm dalam 5 menit. Supertanan dibuang, dan pellet dikeringkan dengan cara membalikan tabung. Setelah kering, pellet ditambahkan dengan 50 µL larutan TE maka didapatkan DNA kromosom. DNA kromosom tersebut didimpan pada lemari es.

Pembuatan Larutan dan Gel untuk Elektroforesis Agarosa

Larutan buffer TBE 5X dibuat dari Tris HCl 1 M pH 8.3, asam borat 0.83 M dan EDTA 10 mM. Gel agarosa terbuat dari agarosa yang ditimbang 0.5 g lalu dilarutkan dalam 50 mL buffer TBE 5X. Gel lalu dituang ke dalam cetakan gel agarosa dan setelah membeku diletakkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi buffer TBE 5X sampai gel terendam.

Elektroforesis Gel Agarosa

Sebanyak 5 µL masing-masing DNA dicampur dengan 1 µL loading dye lalu disuspensi. Suspensi loading dye diinjeksi ke dalam sumur pada gel elektroforesis. Power supply perangkat elektroforesis DNA dengan voltase 60 V selama 2 jam dinyalakan setelah semua sumur terisi. Gel hasil elektroforesis diangkat dan divisualisasi menggunakan transilumin

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA merupakan salah satu tahapan awal dalam teknologi rekayasa DNA, yang menentukan keberhasilan penelitian berikutnya. Kualitas DNA yang dihasilkan sangat dipengaruhi oleh kondisi materi yang digunakan. Isolasi DNA pada tanaman sangat dipengaruhi oleh kesegaran tanaman, hal ini mengakibatkan persiapan jaringan tanaman yang akan diisolasi DNA sebaiknya dilakukan beberapa saat sebelum dilakukannya isolasi DNA. Prinsip dari metode isolasi DNA adalah memurnikan DNA atau memisahkan DNA dari konponen jaringan dengan bantuan senyawa kimia (senyawa alkali) dan mekanik (sentrifugasi). Hal – hal yang perlu diperhatikan dalam isolasi DNA adalah komposisi dan pH buffer, suhu, dan adanya enzim pendegradasi (Maftuchah et al. 2012). Terdapat dua jenis DNA, yaitu DNA kromosomal dan DNA plasmid. DNA kromosomal merupakan DNA yang berfungsi untuk meregulasi semua jalur sintesis protein yang berperan dalam metabolism dan sebagai unit pewarisan sifat.

Hasil isolasi DNA kromosom ditunjukan oleh Gambar 2. DNA kromosom yang digunakan berasal dari daun tumbuhan kunyit (Curcuma domestica) dan jahe (Zingiber officinale). Hasil menunjukan bahwa pita DNA ditemui pada sumur 1, 4, 5, dan 7. Jumlah pita pada sumur 1 sebanyak 1 pitadan berada di atas marker, hal ini juga terjadi pada sumur 4 dan 5. Sementara sumur 7 memiliki dua pita yang keduanya berada di atas pita marker. Hal ini menunjukan bahwa pita DNA yang diisolasi memiliki ukuran lebih besar dari 10.000 bp. Adanya smear yang terbentuk menunjukan adanya kontaminasi protein atau RNA pada hasil isolasi. Kunyit dan jahe merupakan tanaman yang berasal dari family Zingebaraceae dan dikenal sebagai tanaman rempah dan memiliki khasiat obat. Kunyit memiliki khasiat sebagai antioksidan, hepatoprotektif, anti – inflamasi, antikarsinogen, antimikroba, dan dapat meningkatkan imunitas tubuh (Akram et al. 2010). Sementara itu, tanaman jahe berpotensi sebagai obat penyakit diabetes mellitus, obesitas, antiinflamasi, dan menurunkan kolesterol ( Roufogalis 2014). Banyaknya manfaat yang dimiliki oleh kunyit dan jahe, sehingga tidak heran banyak penelitian yang mengangkat tema terkait analisis DNA tanaman kunyit dan jahe, dengan tujuan mengkaji lebih dalam mengenai manfaat yang terdapat di dalam kedua komoditi tersebut.

Penambahan CTAB dan EDTA dalam buffer ekstraksi pada isolasi DNA kromosom berfungsi untuk melisis sel tumbuhan dan mendenaturasi protein. Natrium asetat yang ditambahkan pada buffer lisis 2 akan berikatan dengan EDTA dan berfungsi untuk mengikat debris – debris sel, sementara larutan kloroform : isoamil alkohol (24 : 1) berfungsi untuk mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom. Alkohol absolut yang digunakan dalam percobaan ini berfungsi untuk mengendapkan DNA kromosom yanga akan isolasi (Maftuchah et al. 2012). Kesegaran bahan tanaman yang digunakan isolasi DNA kromosomal sangat mempengaruhi hasil percobaan. Bahan tanaman yang akan digunakan untuk isolasi DNA sebaiknya diambil beberapa saat sebelum dilakukannya isolasi DNA. Hal ini dikarenakan adanya enzim nuclease dapat mendegradasi DNA yang terdapat di dalam jaringan. Adapun beberapa usaha yang dapat dilakukan untuk mencegah kerusakan pada bahan tanaman yang digunakan adalah menyimpan jaringan pada suhu 4ºC. Sementara itu, penyimpanan materi tanaman dalam jangka panjang dilakukan dengan cara penyimpanan pada suhu - 80ºC, pencelupan bahan tanaman  ke dalam nitrogen cair yang kemudian disimpan dalam suhu - 80ºC, dan perlakukan liofilisasi (Maftuchah et al. 2012). 

DAFTAR PUSTAKA

Akram M, Uddin S, Ahmed A, Usmanghani K, Hannah A, Mohiuddin E, Asif M. 2010. Curcuma longa and curcumin : a rivew article. Rom. J. Biol. 55(2):65-70

Dubey RK, Tripathi DN. 2005. Astudy of thermal denaturation/ renaturation in DNA using laser light scattering: A new approach. Indian J. Biochem and Biophysic. 42(5): 301-307.

Elrod S, Stanfield WD. Schaum’s Outlines Genetika Edisi Keempat. Jakarta (ID): Erlangga.

Erdemir A, Aktas M, Dumanli N, Balik DT. 2012. Isolation, cloning and sequence

Maftuchah, Winaya A, Zainudin A. 2012. Teknik Dasar Analisis Biologi Molekuler. Yogyakarta (ID): Deepublish

Mohamed HB, Malla S. 2015. Plasmid stability and maintance of copy number using natural marker. Journal Biology and Agricultural Science. 3(4):368 – 377.

Roufogalis BD. 2014. Zingeber officinale (ginger): a future outlook on its potential in prevention and treatment of diabetes and prediabetic states. New Journal of Science. 1(14): 1-15.