PENDAHULUAN
Karbohidrat (CH2O)n merupakan sumber
energi utama bagi masyarakat, khususnya negara Indonesia. Negara Indonesia
mempunyai banyak hasil pertanian dan perkebunan yang dapat menjadi sumber
karbohidrat, misalnya beras, jagung, ubi jalar, dan ketela pohon. Senyawa
karbohidrat sangat berperan dalam proses metabolisme dalam menghasilkan energi.
Selain itu, beberapa substrat yang mengandung karbohidrat dimanfaatkan sebagai
bahan pengemulsi, pemanis, dan pengental ( Santosa dkk. 2005). Selain itu karbohidrat
juga berperan menjadi komponen penting dalam tubuh makhluk hidup dalam bentuk
serat, seperti selulosa, pektin serta lignin. Kebanyakan karbohidrat yang
masyarakat konsumsi adalah pati yang ada dalam gandum, jagung, beras, kentang
dan padi - padian lainnya (Edahwati 2010). Berdasarkan panjang rantainya,
karbohidrat digolongkan menjadi empat golongan, yaitu monosakarida, disakrida,
oligosakarida, dan polisakarida.
Cadangan karbohidrat pada tumbuhan
biasanya disimpan dalam bentuk pati, inulin, maupun selulosa (komponen dinding
sel pada sel tumbuhan). Pati adalah salah satu jenis karbohidrat yang tergolong
dalam polisakarida dan memiliki kandungan gula pereduksi yang sangat kecil.
Pada umumnyapatiterdiri dari dua komponen, yaitu amilosa dan amilopektin. Amilosa
merupakan komponen pati berantai lurus dan memiliki ikatan a-1,4glikosidik.
Sementara amilopektin merupakan komponen pati berantai bercabang, dan memiliki
ikatan β- 1,6glikosidik pada rantai cabangnya dan α-1,4 glikosidik pada
rantainya. Selain itu, pati dapat dibedakan berdasarkan sumbernya, misalnya
pati kacang hijau, lati kentang, pati ubi jalar, pati singkong, dan pati kacang
polong (Tan et al. 2009). Inulin adalah polisakarida tersususn atas monomer
fruktofiranosa. Rantai inulin tidak bercabang dan memiliki bobot olekul sebesar
5.000. Inulin banyak terdapat pada umbi dahlia, tebu ireng, dan bawang merah.Selulosa
merupakan polisakarida yang tersususn atas monomer glukosa dengan bobot molekul
50.000 – 5000.000. Molekul ini terdapat pada dinding sel tanaman dan memberikan
kekuatan pada dinding sel tanaman tersebut. Struktur kimia selulosa berupa
rantai yang tidak bercabang dan tersususn atas satuan – satuan β – D-
glukopiranosa, dengan ikatan glikosidik β,1-4 (Sumardjo 2009).
Cadangan karbohidrat pada hewan
biasanya disimpan dalam bentuk glikogen. Glikogen adalah molekul karbohidrat
yang tersusun atas monomer glukosa dengan ikatan a-1,4 glikosidik, dengan ikatan
rantai a
- 1,6 glikosidik. Simpanan glikogen banyak disimpan pada organ hati dan otot
rangka.Pembentukan glikogen dari glukosa merupakan proses yang memerlukan
energi.Glikogen hati berfungsi sebagai sumber glukosa darah. Sintesis dan
penguraian glikogen di hati diatur oleh perubahan hormon yang memberi sinyal
mengenai kebutuhan glukosa darah. Glikogen dalam sel otot berfungsi sebagai
sumber nrgi untuk membentuk ATP (Marks et
al. 2000)
METODE
PENELITIAN
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah tabung reaksi, rak tabung reaksi, erlenmeyer, corong plastik, pipet tetes, pipet Mohr, bulb, gelas piala, termometer, penangas air, kaca arloji, waterbath, spektrofotometer, dan sentrifus, sedangkan bahan-bahan yang digunakan adalah darah hewan uji, homogenat hati, akades, Na-wolframat 10%, larutan standar glukosa, kupri tartat, fosfomolibdat, larutan TCA, NaCl, etanol 96%, larutan etil eter, kertas saring, asam sulfat pekat, enzim amilase saliva, H2SO4 0.67 N, buffer kalium fosfat, K2HPO4, HCl, dan glikogen.
Prosedur Percobaan
Penentuan Penentuan
glukosa darah. Sebanyak 1 mL sampel darah
dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer, kemudian ditambahkan 7 mL akuades, 1 mL
Na-wolframat, dan 1 mL larutan H2SO4 0.67 N. Larutan
diaduk hingga homogen dan didiamkan selama 10 menit agar mengendap. Campuran
kemudian disaring, dan diambil filtratnya. Tahap selanjutnya sebanyak 1 mL
kupritartat dimasukkannya tiga tabung reaksi yang berbeda. Tabung pertama
ditambah dengan 1 mL filtrat, tabung kedua 1 mL standar glukosa, dan tabung
ketiga 1 mL akuades. Kemudian ketiga tabung dipanaskan selama 8 menit lalu
ditambah 7 mL akuades pada tiap tabung, setelah itu ditambah 1 mL fosfomolibdat
dan larutan dibaca pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 660 nm.
Isolasi
glikogen. Sebanyak 30 mL homogenat hati ditambahkan dengan 19 mL TCA 10%
kemudian diaduk dan disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit.
Supernatan yang diperoleh diukur. Selanjutnya sebanyak 32 mL etanol 95%
dicampur dengan ekstrak TCA sambil diaduk, kemudian dipindahkan dalam tabung
sentrifus dan disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 3 menit. Pelet yang
dihasilkan dilarutkan dengan 5 mL akuades dan 32 mL etanol 95% lalu
disentrifugasi kembali pada kecepatan yang sama. Pelet dicuci dengan 3 mL etanol
absolut dan 3 mL etil eter kemudian dikeringkan pada cawan petri lalu
ditimbang.
Hidrolisis
glikogen dengan enzim. Sebanyak 2 mL glikogen yang telah diisolasi
dicampurkan pada 1 mL bufer K-fosfat 0.5 M pH 6.9 dan 1 mL NaCl 0.2 M serta
ditambah akuades 14
mL. simpan disuhu ruang selama 5
menit kemudian ditambah 2 mL saliva, campuran diambil 0.5 mL pada tabung reaksi
(0) lalu dipanaskan 100 0C selama 1 menit lalu ditambahkan 4.5 mL
aquades lalu ditambahkan 1 mL kupritartat kemudian dipanaskan 100 0C selama 8 menit. Selanjutnya
ditambahkan 7 mL akuades dan 1 mL fosfomolibdat lalu di ukur absorbandi pada
panjang gelombang 660. Sisa campuran glukogen dan saliva disimpan pada suhu 37 0C,
dan setiap 3, 6, 12 dan 15 menit diambil 0.5 mL lalu diuji folin wu seperti
tabung ke 0.
Hidrolisis
glikogen dengan asam. Glukosa sebanyak 2 mL dicampurkan dengan 2 mL HCl 4 N
dan dikocok. Lalu dicampurkan 0.5 mL pada 2.5 mL K2HPO4 1
M dan ditambah akuades 7
mL. lalu diambil 0.5 mL setiap 0,
15, 30 dan 45 menit dan disimpan pada tabung reaksi. Kemudian setiap tabung
tersebut dipanaskan 100 0C selama 1 menit lalu ditambahkan 4.5 mL
aquades lalu ditambahkan 1 mL kupritartat kemudian dipanaskan 100 0C selama 8 menit. Selanjutnya
ditambahkan 7 mL akuades dan 1 mL fosfomolibdat lalu di ukur absorbandi pada
panjang gelombang 660.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Metode
dengan menggunakan reagent Folin Ciocalteu mempunyai prinsip dasar adanya
perubahan warna akibat reaksi reduksi oksidasi yang terjadi pada larutan
membentuk kompleks biru (hasil reaksi kromofor dengan kompleks fosfotungstat
dan fosfomolibdat). Reagent ini banyak digunakan untuk menguji senyawa -
senyawa yang mengandung gugus fenolik ( Blainski et al 2013). Reagent ini
ditemukan oleh Folin Denis yang saat itu digunakan untuk menguji tirosin pada protein.
Folin Ciocalteu dapat dibuat dengan 100 g sodium tungstat (VI) dihidrat dan 25
g sodium molibdat (VI) dihidrat dengan 700 mL air destilasi (Agbor et al 2014).
Darah
merupakan jaringan yang berfungsi sebagai pengangkut (carrier) pada sistem
kardiovaskuler. Secara normal volume darah yang berada dalam sistem sirkulasi
pada seorang laki – laki dengan berat badan 70 kg berkisar 8% dari berat badan.
Berdasarkan jumlah tersebut sekitar 55% merupakan plasma darah. Viskositas
darah sebagian bergantung pada hematokrit (Ht), yaitu persentase sel – sel
darah merah berbanding dengan volume darah. Nilai Ht normal untuk laki – laki
adalah ± 42% sedangkan wanita sebesar ± 38%. Fungsi darah dalam tubuh manusia
adalah sebagai jaringan transportasi oksigen, gula, hormon, dan sisa
metabolisme. Selain itu, jaringan darah juga berfungsi mendistribusikan panas
tubuh dan memelihara keseimbangan osmolaritas dalam tubuh (Mutaqin 2009).
Molekul glukosa sangat penting untuk metabolisme setiap organisme. Molekul glukosa merupakan salah satu sumber energi yang paling efektif dalam menghasilkan ATP. Molekul ATP yang dihasilkan dari pemecahan glukosa akan digunakan untuk menjalankan sistem metabolisme dalam tubuh. Selain itu, sel – sel otak dan saraf yang tidak mampu menyimpan cadangan energi, sangat bergantung pada kadar glukosa dalam darah untuk menjalankan fungsinya. Namun, kelebihan glukosa pada manusi dapat menimbulkan penyakit, begitu pula sebaliknya. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Erol dan Nuray (2011) penyakit hypoglikimia atau penyakit rendahnya kadar glukosa dalam darah yang sering terjadi pada penderita diabetes Tipe 1 (tanpa perawatan insulin) menunjukan adanya perubahan psikologis pada penderita berupa rasa takut berlebihan dan kurangnya kepercayaan diri. Namun kelebihan glukosa dalam darah dapat memicu timbulnya penyakit hiperglikemia dan diabetes meitus tipe 2. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Frances et al (2010) menyatakan bahwa secara signifikan hiperglikemia pada tikus wistar dapat menginduksi terjadinya peningkatan radikal hidroksi yang berkorelasi dengan peningkatan lipid peroksidase yang memicu terjadinya diabetes. Menurut Szableski (2012) menyatakan bahwa kadar glukosa pada manusia normal adalah 90 – 130 mg/dL.Sementara pada penderita diabetes kadar gula darahnya dapat mencapai angka 180 mg/ dL setelah makan.
Pada percobaan penentuan kadar glukosa dalam darah dilakukan dengan menggunakan darah ayam. Pada percobaan ini digunakan reagent Folin Wu yang mengandung Na- Wolframat. Prinsip dari percobaan ini adalah ion kupri pada reagent direduksi akan direduksi oleh glukosa membentuk kupro dan mengendap menjadi Cu2O. Penambahan fosfomolibdat maka Cu2O akan melarut menjadi oksida Mo yang berwarna biru, dengan menggunakan prinsip kolorimetri kadar glukosa dapat diukur dengan menggunkan spektrofotometri pada panjang gelombang 660 nm.
Tabel 1 menunjukan hasil pengukuran kadar glukosa pada darah ayam. Hasil menunjukan bahwa darah ayam mengandung 81. 3690 mg/dL dan 93.4247 mg/dL. Hal ini menunjukan bahwa darah ayam mengandung kadar glukosa lebih sedikit dibandingkan dengan kadar glukosa pada darah manusia normal.
Isolasi glikogen dilakukan dengan
penambahan larutan TCA 10%, penambahan larutan ini bertujuan untuk merusak
komponen protein pada membran sel, sehingga molekul glikogen dapat keluar.
Selain itu pada percobaan juga dilakukan penambahan etanol 95%, larutan ini
berfungsi sebagai pelarut glikogen yang dihasilkan. Perlakukan sentrifugasi
bertujuan untuk memisahkan fraksi glikogen dari komponen sel lainnya. Hasil
isolasi glikogen ditunjukan pada tabel 2. Hasil menunjukan bahwa massa glikogen
yang terisolasi dari 25 mL filtrat homogenat sebesar 0.00324 g/mL. Kadar
glikogen pada hati sapi dipengaruhi oleh beberapa faktor , yaitu tipe serat
otot, spesies, nutrisi, level stress, dan genetik. Selain itu, konsentrasi
glikogen pada hati sapi pascasembelih dipengaruhi oleh pH lingkungan
(Hargreaves et al 2009). Selain itu menurut penelitian yang dilakukan oleh
Prasetyo dkk (2009) kandungan glikogen pada daging sapi dapat menentukan kualitas
kesegaran daging tersebut. Metabolisme karbohidrat pada hewan pemamah biak
sedikit berbeda dengan hewan lainnya. Hewan pemamah biak (sapi) memiliki enzim β-
amilase yang dihasilkan oleh bakteri di dalam lambung sapi yang dapat memecah
polisakarida selulosa dari rumput. Hasil peecahan dari selulosa berupa glukosa,
kemudian diserap oleh sistem pencernaan sapi. Glukosa yang diserap oleh sapi
akan digunakan sebagai sumber energi sintesis protein, sementara kelebihan
glukosa akan disimpan dalam bentuk glikogen aupun dirubah menjadi
lemak.Pembentukan glikogen (glikogenesis) terjadi di sel hati. Mula – mula
glukosa dirubah menjadi glukosa 6- osfat. Glukosa 6- fosfat kemudian dirubah
menjadi glukosa1- fosfat dengan bantuan enzim fosfoglukomutase. Glukosa 1-
fosfat kemudian dirubah menjadi UDP – glukosa dengan penambahan molekul UDP dan
bantuan UDP – glukosa pyrofosforilase. Penggabungan moleku UDP – glukosa dengan
bantuan enzim glikogen sintetase akan membentuk molekul glikogen, yang kemudian
disimpan di hati (Marks 2000).
Pada
percobaan penentuan kadar glukosa dari hidrolisis glikogen hati sapi, dilakukan
dengan dua cara yang berbeda, yaitu dengan hidrolisis dengan enzim dan
hidrolisis dengan asam. Hidrolisis glikogen dengan enzim dilakukan dengan
penambahan enzim dari air liur. Air liur mengandung enzim a-
amilase yang dapat memecah molekul polisakarida yang mengandung ikatan a-
1,4 glikosidik (glikogen) menjadi molekul yang lebih sederhana (glukosa).
Penambahan bufer K – fosfat pada percobaan hidrolisis oleh enzim bertujuan
untuk menjaga pH lingkungan agar 6.9, sehingga enzim dapat bekerja secara
optimal. Perlakukan inkubasi pada suhu 25°C bertujuan untuk mempercepat reaksi
enzim, karena enzim amilase bekerja optimal pada suhu 25°C(Marks 2000).
Penambahan reagent folin wo berupa Na- wolframat bertujuan untuk medeteksi
adanya glukosa pada larutan, glukosa pada larutan akan mereduksi Na – wolframat
dan membentuk kompleks berwarna biru, yang kemudian secara kolorimetri
konsentrasi glukosa dapat diukur dengan spektrofotometer. Adapun penambahan
asam sulfat bertujuan untuk menciptakan suasa asam pada campuran, sehingga
reaksi dapat berlangsung. Data yang diperoleh (Tabel 3) menunjukan bahwa
konsentrasi glukosa terbesar terjadi pada menit ke – 15, sebesar 0.1761 mg/mL dengan nilai molaritas
sebesar 1.9569
µmol.
Hal ini menunjukan bahwa semakin lama waktu reaksi semakin banyak molekul
glikogen yang dihidrolisis menjadi glukosa oleh enzim amilase. Prinsip kerja
hidrolisis glikogen oleh enzim amilase adalah, adanya pemutusan ikatan a-
1,4 glikosidik pada glikogen menjadi monomernya (glukosa). Reaksi ini bersifat
spesifik (Marks 2000). Keuntungan proses hidrolisis dengan metode enzimatis
adalah reaksi berlangsung spesifik, sehingga substrat yang dihasilkan tepat,
efisien dan memerlukan energi yang kecil. Hal ini dikarenakan sifat enzim yang
dapat menurunkan energi aktivasi dalam reaksinya (Sumardjo 2009).
Sementara
itu, percobaan hidrolisis glikogen oleh asam dilakukan dengan menggunakan HCl 4
N sebagai senyawa asam penghidrolisis. Asam kuat yang ditambahkan dapat
menghidrolisis glikogen ecara acak, sehingga dihasilkan molekul bukan hanya
glukosa tetapi juga molekul lainnya, seperti disakarida. Penambahan reagent Na
– wolframat berfungsi mendeteksi keberadaan glukosa pada larutan. Berdasarkan
hasil yang diperoleh dari percobaan besar konsentrasi glukosa pada menit ke –
15 yang dihasilkan sebesar 0.0469
mg/mL dengan besar olaritas sebesar 0.5211 µmol. Dibandingkan dengan
konsentrasi glukosa dari hidrolisis glikogen oleh enzim, hasil konsentrasi
glukosa oleh asam lebih kecil. Hal ini dikarenakan asam menghidrolisis glikogen
secara acak sehingga sedikit molekul glukosa yang dihasilkan. Dilihat dari
nilai perbandingan glukosa dengan glikogen pada menit ke 15, jga menunjukan
nilai perbandingan hidrolisis glikogen oleh enzim lebih besar (0.060398) dibandingakan
hidrolisis oleh asam (0.016083).
DAFTAR PUSTAKA
Agbor GA, Vinson JA, Donnely PE. Folin-Ciocalteau
Reagent for Polyphenolic Assay.
International Journal of Food Science, Nutrition and Dietetics. 3(8): 147 –
156.
Blainski A, Lopes GC, Mello JCP. 2013. Application
and Analysis of the Folin Ciocalteu Method for the Determination of the Total
Phenolic Content from Limonium Brasiliense L. J. Mol. 1(18): 6852 – 6865. Doi: :10.3390/molecules18066852.
Edahwati
L. 2010. Perpindahan ,assa karbohidrat menjadi glukosa dari buah kersen dengan
proses hidrolisis. Jurnal Penelitian Ilmu Teknik. 1(10): 1 – 5.
Erol O, Nuray E. 2011. Hypoglycemia Fear and
Self-efficacy of Turkish Patients Receiving Insulin Therapy. Asian Nursing Research. 5 (11): 222 –
228, doi:10.1016/j.anr.2011.12.001
Tidak ada komentar:
Posting Komentar